激光掃描體視顯微鏡采集的注意事項

激光掃描體視顯微鏡對于要觀(guān)察的區域，應先用明視場(chǎng)顯微鏡和普通熒光顯微鏡進(jìn)行定位，當然也可使用共聚焦系統的體視顯微鏡進(jìn)行定位。但對于大多數初學(xué)者或非專(zhuān)業(yè)研究人員來(lái)說(shuō)，在只使用共聚焦模式的情況下，常很難找到合適的焦平面。所以應該學(xué)會(huì )使用共聚焦系統配備的顯微鏡，以常規模式預觀(guān)察樣品，因為要在一張含有數百個(gè)胚胎的標本中找出特定發(fā)育時(shí)期的某種基因的表達非常困難，如直接采用共聚焦模式掃描標本，常很費時(shí)。許多儀器具備快速掃描功能，可在一定程度上彌補這種缺陷，但在快掃模式下，其分辨率低。因此，當尋找少見(jiàn)的現象時(shí)，較容易的方法是使用普通模式觀(guān)察切片，一旦發(fā)現即刻切換到共聚焦模式進(jìn)行圖像采集。

成功進(jìn)行共聚焦圖像采集的關(guān)鍵是掌握透鏡NA，針孔大小和圖像亮度之間的互相配合，對于亮度，應以可獲得最佳圖像的最小激光強度為標準，即在保證成像的情況下，激光功率應盡可能小�？墒褂密浖�的放大功能放大圖像，并將所得的圖像與高NA物鏡所得的圖像進(jìn)行比較。在體視顯微鏡特定成像參數的設定操作時(shí)，應在標本要觀(guān)察的特定區域以外進(jìn)行，防止有價(jià)值的區域發(fā)生光漂白。常包括設定PMT探測器的增益和背底水平，以及何時(shí)的針孔大小，保證在可接受的分辨率和足夠的反差之間獲得平衡，使用最低的激光功率以避免發(fā)生過(guò)多的光漂白。許多儀器具有顏色表，有助于設定圖像中的正確動(dòng)態(tài)范圍。在8比特系統中，該表將最黑的像素設定為0.為偽彩綠色，而最亮的像素設定為255，為偽紅色。增益和背底水平以及針孔的調節，使其變化范圍在0-255之間，這種調節也可通過(guò)肉眼進(jìn)行。但在進(jìn)行實(shí)際圖像采集時(shí)，標本的熒光不均勻，可能超出范圍，因此，亮的區域可能遮蓋暗的區域。

采集的圖像常儲存在計算機的硬盤(pán)中，而后再進(jìn)行拷貝。通常在圖像采集過(guò)程中，應采集盡可能多的圖像，如果需要刪除，可在隨后的圖像處理過(guò)程中刪除不滿(mǎn)意的圖像。有時(shí)開(kāi)始看似不滿(mǎn)意的圖像，在日后的進(jìn)一步復審中可能變得價(jià)值非凡，因此，在進(jìn)行圖像刪除時(shí)，應慎之又慎！要與以前制備標本時(shí)各項條件保持一致，再復制制備標本非�？嚯y，有時(shí)是不可能的。